PCR reaksiyalarında müdaxilə faktorları

PCR reaksiyası zamanı tez-tez bəzi müdaxilə edən amillərlə qarşılaşılır.
PCR-nin çox yüksək həssaslığına görə, çirklənmə PCR nəticələrinə təsir edən ən mühüm amillərdən biri hesab olunur və yanlış müsbət nəticələr verə bilər.
Yalan-mənfi nəticələrə səbəb olan müxtəlif mənbələr də eyni dərəcədə kritikdir. Əgər PZR qarışığının bir və ya bir neçə əsas hissəsi və ya gücləndirmə reaksiyasının özü maneə törədilirsə və ya müdaxilə edilirsə, diaqnostik analiz əngəllənə bilər. Bu, səmərəliliyin azalmasına və hətta yanlış mənfi nəticələrə səbəb ola bilər.
İnhibisyona əlavə olaraq, nümunənin hazırlanmasından əvvəl daşınma və/yaxud saxlama şəraitinə görə hədəf nuklein turşusunun bütövlüyünün itirilməsi baş verə bilər. Xüsusilə, yüksək temperatur və ya qeyri-kafi saxlama hüceyrələrin və nuklein turşularının zədələnməsinə səbəb ola bilər. Hüceyrə və toxuma fiksasiyası və parafinin yerləşdirilməsi DNT parçalanmasının yaxşı məlum səbəbləri və davamlı problemdir (bax Şəkil 1 və 2). Bu hallarda hətta optimal izolyasiya və təmizlənmə də kömək etməyəcək.

Şəkil 1 | İmmobilizasiyanın DNT bütövlüyünə təsiri
Agaroz gel elektroforezi göstərdi ki, yarılmaların parafin bölmələrindən təcrid olunmuş DNT-nin keyfiyyəti xeyli dəyişdi. Ekstraktlarda fiksasiya üsulundan asılı olaraq müxtəlif orta fraqment uzunluqlu DNT mövcud olmuşdur. DNT yalnız yerli dondurulmuş nümunələrdə və tamponlanmış neytral formalin içərisində sabitləndikdə qorunub saxlanıldı. Güclü turşulu Bouin fiksatorunun və ya tamponsuz, qarışqa turşusu tərkibli formalinin istifadəsi DNT-nin əhəmiyyətli dərəcədə itirilməsi ilə nəticələndi. Qalan fraksiya yüksək dərəcədə parçalanmışdır.
Solda fraqmentlərin uzunluğu kilobaza cütləri ilə ifadə edilir (kbp)

Şəkil 2 | Nuklein turşusu hədəflərinin bütövlüyünün itirilməsi
(a) Hər iki zəncirdə 3′-5′ boşluq hədəf DNT-də qırılma ilə nəticələnəcək. DNT sintezi hələ də kiçik fraqmentdə baş verəcəkdir. Bununla belə, DNT fraqmentində primer tavlama yeri yoxdursa, yalnız xətti gücləndirmə baş verir. Ən əlverişli halda, fraqmentlər bir-birini bərpa edə bilər, lakin məhsuldarlıq kiçik və aşkarlama səviyyəsindən aşağı olacaqdır.
(b) Əsasların depurinasiya və timidin dimerinin əmələ gəlməsi nəticəsində itirilməsi H-bağlarının sayının azalmasına və Tm-nin azalmasına səbəb olur. Uzadılmış istiləşmə fazası zamanı primerlər matris DNT-dən əriyəcək və daha az sərt şəraitdə belə tavlanmayacaq.
(c) Bitişik timin əsasları TT dimerini əmələ gətirir.
Molekulyar diaqnostikada tez-tez baş verən digər ümumi problem, fenol-xloroformun çıxarılması ilə müqayisədə hədəf nuklein turşularının optimaldan daha az sərbəst buraxılmasıdır. Həddindən artıq hallarda bu, yalançı neqativlərlə əlaqələndirilə bilər. Hüceyrə zibilinin qaynadılması və ya fermentativ həzm edilməsi ilə çox vaxta qənaət etmək olar, lakin bu üsul tez-tez nuklein turşusunun qeyri-kafi sərbəst buraxılması səbəbindən aşağı PCR həssaslığına səbəb olur.

Gücləndirmə zamanı polimeraza aktivliyinin inhibə edilməsi

Ümumiyyətlə, inhibe, suboptimal PCR nəticələrinə səbəb olan bütün amilləri təsvir etmək üçün konteyner konsepsiyası kimi istifadə olunur. Ciddi biokimyəvi mənada inhibə fermentin fəaliyyəti ilə məhdudlaşır, yəni DNT polimerazanın aktiv sahəsi və ya onun kofaktoru (məsələn, Taq DNT polimeraza üçün Mg2+) ilə qarşılıqlı təsir vasitəsilə substrat-məhsul çevrilməsini azaldır və ya qarşısını alır.
Nümunədə olan komponentlər və ya müxtəlif tamponlar və reagentlər olan ekstraktlar birbaşa fermenti inhibə edə və ya onun kofaktorlarını (məsələn, EDTA) tuta bilər, bununla da polimerazı inaktivləşdirir və nəticədə azalmış və ya yanlış mənfi PCR nəticələrinə gətirib çıxarır.
Bununla belə, reaksiya komponentləri və hədəf tərkibli nuklein turşuları arasındakı bir çox qarşılıqlı təsirlər də "PCR inhibitorları" kimi təyin olunur. İzolyasiya ilə hüceyrənin bütövlüyü pozulduqda və nuklein turşusu sərbəst buraxıldıqdan sonra nümunə ilə onun ətrafındakı məhlul və bərk faza arasında qarşılıqlı əlaqə yarana bilər. Məsələn, "təmizləyicilər" qeyri-kovalent qarşılıqlı təsirlər vasitəsilə tək və ya iki zəncirli DNT-ni bağlaya və sonda PCR reaksiya qabına çatan hədəflərin sayını azaltmaqla izolyasiya və təmizlənməyə müdaxilə edə bilər.
Ümumiyyətlə, PZR inhibitorları əksər bədən mayelərində və klinik diaqnostik testlər üçün istifadə olunan reagentlərdə (sidikdə karbamid, qanda hemoglobin və heparin), qida əlavələrində (üzvi komponentlər, qlikogen, yağ, Ca2+ ionları) və ətraf mühitdəki komponentlərdə (fenollarda) mövcuddur. , ağır metallar)

Daha çox yayılmış PCR inhibitorları bakteriya və eukaryotik hüceyrələrdə, hədəf olmayan DNT-də, toxuma matrislərinin DNT-ni bağlayan makromolekullarında və əlcəklər və plastiklər kimi laboratoriya avadanlıqlarında tapıla bilər. Ekstraksiya zamanı və ya ondan sonra nuklein turşularının təmizlənməsi PCR inhibitorlarının çıxarılması üçün üstünlük verilən üsuldur.
Bu gün müxtəlif avtomatlaşdırılmış hasilat avadanlığı bir çox əl protokollarını əvəz edə bilər, lakin hədəflərin 100% bərpası və/və ya təmizlənməsi heç vaxt əldə edilməmişdir. Potensial inhibitorlar təmizlənmiş nuklein turşularında hələ də mövcud ola bilər və ya artıq təsir göstərmiş ola bilər. İnhibitorların təsirini azaltmaq üçün müxtəlif strategiyalar mövcuddur. Müvafiq polimerazanın seçilməsi inhibitor fəaliyyətinə əhəmiyyətli təsir göstərə bilər. PCR inhibisyonunu azaltmaq üçün digər sübut edilmiş üsullar polimeraza konsentrasiyasının artırılması və ya BSA kimi əlavələrin tətbiqidir.
PCR reaksiyalarının qarşısının alınması daxili proses keyfiyyətinə nəzarətin (IPC) istifadəsi ilə nümayiş etdirilə bilər.
Etanol, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, izopropanol və fenol kimi ekstraksiya dəstindəki bütün reagentlərin və digər məhlulların hərtərəfli yuyulma mərhələsi ilə nuklein turşusu təcridindən çıxarılmasına diqqət yetirilməlidir. Konsentrasiyalarından asılı olaraq, onlar PCR-ni aktivləşdirə və ya inhibə edə bilərlər.