PCR reaksiyalarında müdaxilə amilləri

PCR reaksiyası zamanı bəzi müdaxilə edən amillərə tez-tez rast gəlinir.
PCR-in çox yüksək həssaslığına görə çirklənmə PCR nəticələrinə təsir edən ən vacib amillərdən biri hesab olunur və yalançı müsbət nəticələr verə bilər.
Yalançı-mənfi nəticələrə səbəb olan müxtəlif mənbələr də eyni dərəcədə vacibdir. PCR qarışığının bir və ya daha çox vacib hissəsi və ya amplifikasiya reaksiyasının özü inhibə edilərsə və ya müdaxilə edilərsə, diaqnostik analiz mane ola bilər. Bu, səmərəliliyin azalmasına və hətta yalançı-mənfi nəticələrə səbəb ola bilər.
İnhibə ilə yanaşı, nümunə hazırlanmadan əvvəl göndərmə və/və ya saxlama şərtləri səbəbindən hədəf nuklein turşusunun bütövlüyünün itirilməsi baş verə bilər. Xüsusilə, yüksək temperatur və ya qeyri-kafi saxlama hüceyrələrin və nuklein turşularının zədələnməsinə səbəb ola bilər. Hüceyrə və toxuma fiksasiyası və parafin yerləşdirilməsi DNT parçalanmasının məlum səbəbləridir və davamlı problemdir (Şəkil 1 və 2-yə baxın). Bu hallarda, hətta optimal izolyasiya və təmizləmə də kömək etməyəcəkdir.

Şəkil 1 | İmmobilizasiyanın DNT bütövlüyünə təsiri
Agaroza gel elektroforezi göstərdi ki, autopsiyaların parafin kəsiklərindən təcrid olunmuş DNT-nin keyfiyyəti xeyli dərəcədə dəyişir. Fiksasiya üsulundan asılı olaraq ekstraktlarda müxtəlif orta fraqment uzunluqlarında DNT mövcud idi. DNT yalnız yerli dondurulmuş nümunələrdə və buferləşdirilmiş neytral formalində fiksasiya edildikdə qorunurdu. Güclü turşulu Bouin fiksatorunun və ya buferləşdirilməmiş, qarışqa turşusu tərkibli formalinin istifadəsi DNT-nin əhəmiyyətli dərəcədə itirilməsinə səbəb oldu. Qalan fraksiya yüksək dərəcədə fraqmentləşdirilib.
Solda, fraqmentlərin uzunluğu kilobayt cütləri (kbp) ilə ifadə olunur.

Şəkil 2 | Nuklein turşusu hədəflərinin bütövlüyünün itirilməsi
(a) Hər iki zəncirdə 3′-5′ boşluq hədəf DNT-də qırılmaya səbəb olacaq. Kiçik fraqmentdə DNT sintezi yenə də baş verəcək. Lakin, DNT fraqmentində praymerin tavlanma yeri yoxdursa, yalnız xətti amplifikasiya baş verir. Ən əlverişli halda, fraqmentlər bir-birini yenidən doydura bilər, lakin məhsuldarlıq kiçik olacaq və aşkarlama səviyyələrindən aşağı olacaq.
(b) Əsasların itkisi, əsasən depurinasiya və timidin dimerinin əmələ gəlməsi səbəbindən, H-rabitələrinin sayının azalmasına və Tm-nin azalmasına səbəb olur. Uzunmüddətli istiləşmə mərhələsində primerlər matrix DNT-dən əriyəcək və daha az sərt şəraitdə belə tavlanmayacaq.
(c) Bitişik timin əsasları TT dimeri əmələ gətirir.
Molekulyar diaqnostikada tez-tez rast gəlinən digər ümumi problem, fenol-xloroform ekstraksiyası ilə müqayisədə hədəf nuklein turşularının optimaldan daha az sərbəst buraxılmasıdır. Həddindən artıq hallarda bu, yalançı mənfi nəticələrlə əlaqələndirilə bilər. Qaynadılmış lizis və ya hüceyrə qalıqlarının fermentativ həzm edilməsi ilə çox vaxta qənaət etmək olar, lakin bu üsul tez-tez nuklein turşusunun qeyri-kafi sərbəst buraxılması səbəbindən aşağı PCR həssaslığına səbəb olur.

Amplifikasiya zamanı polimeraza aktivliyinin inhibə edilməsi

Ümumiyyətlə, inhibisiya, suboptimal PCR nəticələrinə səbəb olan bütün amilləri təsvir etmək üçün bir konteyner anlayışı kimi istifadə olunur. Sırf biokimyəvi mənada, inhibisiya fermentin aktivliyi ilə məhdudlaşır, yəni DNT polimerazasının aktiv mərkəzi və ya onun kofaktoru (məsələn, Taq DNT polimerazası üçün Mg2+) ilə qarşılıqlı təsir yolu ilə substrat məhsulunun çevrilməsini azaldır və ya qarşısını alır.
Nümunədəki komponentlər və ya reagentlər ehtiva edən müxtəlif buferlər və ekstraktlar fermenti birbaşa inhibə edə və ya onun kofaktorlarını (məsələn, EDTA) tuta bilər, bununla da polimerazanı inaktivləşdirə və öz növbəsində azalmış və ya yalançı mənfi PZR nəticələrinə səbəb ola bilər.
Lakin, reaksiya komponentləri ilə hədəf tərkibli nuklein turşuları arasında bir çox qarşılıqlı təsirlər də "PCR inhibitorları" kimi təyin olunur. Hüceyrənin bütövlüyü izolyasiya ilə pozulduqdan və nuklein turşusu sərbəst buraxıldıqdan sonra nümunə ilə onu əhatə edən məhlul və bərk faza arasında qarşılıqlı təsirlər baş verə bilər. Məsələn, "zibil toplayanlar" kovalent olmayan qarşılıqlı təsirlər vasitəsilə tək və ya ikiqat zəncirli DNT-yə bağlana və nəticədə PCR reaksiya damarına çatan hədəflərin sayını azaltmaqla izolyasiya və təmizlənməyə mane ola bilər.
Ümumiyyətlə, PZR inhibitorları klinik diaqnostik testlər üçün istifadə edilən əksər bədən mayelərində və reagentlərdə (sidikdə üre, qanda hemoglobin və heparin), qida əlavələrində (üzvi komponentlər, qlikogen, yağ, Ca2+ ionları) və ətraf mühitdəki komponentlərdə (fenollar, ağır metallar) mövcuddur.

Daha çox yayılmış PZR inhibitorlarına bakteriya və ökaryotik hüceyrələrdə, hədəf olmayan DNT-də, toxuma matrislərinin DNT-yə bağlanan makromolekullarında və əlcəklər və plastiklər kimi laboratoriya avadanlıqlarında rast gəlinir. Ekstraksiya zamanı və ya sonra nuklein turşularının təmizlənməsi PZR inhibitorlarını çıxarmaq üçün üstünlük verilən üsuldur.
Bu gün müxtəlif avtomatlaşdırılmış ekstraksiya avadanlıqları bir çox əl protokollarını əvəz edə bilər, lakin hədəflərin 100% bərpası və/və ya təmizlənməsi heç vaxt əldə edilməyib. Potensial inhibitorlar təmizlənmiş nuklein turşularında hələ də mövcud ola bilər və ya artıq qüvvəyə minmiş ola bilər. İnhibitorların təsirini azaltmaq üçün müxtəlif strategiyalar mövcuddur. Müvafiq polimeraza seçimi inhibitor aktivliyinə əhəmiyyətli dərəcədə təsir göstərə bilər. PCR inhibisiyasını azaltmaq üçün digər sübut olunmuş üsullar polimeraza konsentrasiyasını artırmaq və ya BSA kimi əlavələrin tətbiqidir.
PCR reaksiyalarının inhibə edilməsi daxili proses keyfiyyətinə nəzarət (İPK) istifadə etməklə nümayiş etdirilə bilər.
Ekstraksiya dəstindəki bütün reagentləri və digər məhlulları, məsələn, etanol, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, izopropanol və fenolu nuklein turşusu izolatından diqqətlə yuma mərhələsi ilə çıxarmaq üçün diqqətli olmaq lazımdır. Konsentrasiyalarından asılı olaraq, onlar PCR-i aktivləşdirə və ya inhibə edə bilərlər.