PCR reaksiyalarında müdaxilə amilləri

PCR reaksiyası zamanı bəzi müdaxilə edən amillər tez-tez rast gəlinir.
PCR-in çox həssaslığı səbəbindən çirklənmə PCR nəticələrinə təsir edən ən vacib amillərdən biri hesab olunur və saxta müsbət nəticələr verə bilər.
Eyni dərəcədə tənqidi yalan-mənfi nəticələrə səbəb olan müxtəlif mənbələrdir. PCR qarışığının və ya gücləndirmə reaksiyasının bir və ya daha çox vacib hissələri inhibə və ya müdaxilə olunursa, diaqnostik təhlilə mane ola bilər. Bu, azaldılmasına və hətta yalan mənfi nəticələrə səbəb ola bilər.
İnhibitə əlavə olaraq, hədəf nukleik turşusu bütövlüyünün itkisi, nümunə hazırlığından əvvəl göndərmə və / və ya saxlama şəraiti səbəbindən baş verə bilər. Xüsusilə, yüksək temperatur və ya qeyri-kafi anbar hüceyrələrin və nukleik turşuların zərərinə səbəb ola bilər. Hüceyrə və toxuma fiksasiyası və parafin daxil edilməsi DNT parçalanmasının və israrlı bir problemin məlum səbəbləridir (bax 1 və 2-ci rəqəmlər). Bu hallarda, hətta optimal təcrid və təmizlənmə də kömək etməyəcəkdir.

Şəkil 1 | DNT bütövlüyünə immobilizasiyanın təsiri
Agarose Gel Elektroforezi göstərdi ki, otopsiyanın parafin hissələrindən təcrid olunmuş DNT-nin keyfiyyəti xeyli yaxşı oldu. Fixasion metodundan asılı olaraq ekstraktlarda müxtəlif orta fraqment uzunluqların DNT-i mövcud idi. DNT yalnız doğma dondurulmuş nümunələrdə və buferli neytral formalində sabit olduqda qorunurdu. Güclü bir turşu bouin fiksator və ya qeyri-bərabər, formal turşu ehtiva edən forminin istifadəsi, DNT-nin əhəmiyyətli bir itkisi ilə nəticələndi. Qalan fraksiya çox parçalanmışdır.
Solda, qırıqların uzunluğu Kilobase Cütləri (KBP) ilə ifadə olunur

Şəkil 2 | Nuklein turşusu hədəflərinin bütövlüyünün itkisi
(a) Hər iki ipdəki 3'-5 'boşluq hədəf DNT-də fasilə ilə nəticələnəcək. DNT-nin sintezi hələ də kiçik fraqmentdə baş verəcəkdir. Bununla birlikdə, DNT fraqmentində bir astar ilahi sayt itkin, yalnız xətti gücləndirmə baş verir. Ən əlverişli halda, fraqmentlər bir-birlərini yenidən düzəldə bilər, lakin məhsuldarlıqlar kiçik və aşağıda aşkar səviyyələrdən aşağı olacaqdır.
(b) Əsasən kontensasiya və thymidine dimer meydana gəlməsi ilə əlaqədar bazaların itkisi, H-istiqrazların sayının azalmasına və TM-nin azalmasına səbəb olur. Uzun istiləşmə mərhələsində astarlar Matrix DNT-dən uzaqlaşacaq və hətta daha az sərt şəraitdə də ilkin olmayacaqdır.
(c) bitişik timin əsasları bir tt dimer meydana gətirir.
Tez-tez molekulyar diaqnostikada baş verən digər bir problem, fenol-xloroform hasilatı ilə müqayisədə hədəf nukleik turşuların optimal buraxılmasıdır. Həddindən artıq hallarda, bu yalan mənfi cəhətlərlə əlaqələndirilə bilər. Çox vaxt, hüceyrə zibilinin qaynar və enzimatik həzmini qaynar, lakin bu metodun nüvə turşusu azad edilməməsi səbəbindən aşağı PCR həssaslığı ilə nəticələnə bilər.

Gücləndirmə zamanı polimeraz fəaliyyətinin inhibisiyası

Ümumiyyətlə, inhibe, suboptimal PCR nəticələrinə səbəb olan bütün amilləri təsvir etmək üçün konteyner konsepsiyası kimi istifadə olunur. Qəti şəkildə biokimyəvi mənada, inhibisiya fermentin fəaliyyəti ilə məhdudlaşır, yəni DNT polimerazın və ya onun kuklasının (məsələn, Taq DNT polimerazı üçün (məsələn, mq2 + + +) qarşılıqlı əlaqə vasitəsilə substrat məhsulun çevrilməsini azaldır və ya qarşısını alır.
Nümunə və ya müxtəlif tamponlar və ekstraktlar olan komponentlər ehtiva edən ekstraktlar fermenti birbaşa maneə törədir və ya patronları (məsələn Edta), bununla da polimerazı və ya saxta mənfi pcr nəticələrə səbəb olur.
Bununla birlikdə, reaksiya komponentləri ilə hədəf tərkibli nukleik turşuları arasında bir çox qarşılıqlı təsir də 'Pcr inhibitorları' olaraq təyin olunur. Bir dəfə hüceyrənin bütövlüyü təcrid olunduqdan və nuklein turşusu sərbəst buraxılır, nümunə və ətrafdakı həll və möhkəm faza arasında qarşılıqlı təsirlər baş verə bilər. Məsələn, 'Zibillər' qeyri-kobalent olmayan qarşılıqlı təsirlər vasitəsilə tək və ya iki qapalı olan DNT-ni bağlaya bilər və nəticədə PCR reaksiya gəmisinə çatan hədəflərin sayını azaltmaqla təcrid və təmizlənməyə müdaxilə edə bilər.
Ümumiyyətlə, PCR inhibitorları, klinik diaqnostika testləri (sidikdə, hemoglobin və hemoglobin və hemoglobin, glikogen, yağ, ca2 + ionları) və ətrafdakı komponentlər (fenollar, ağır metallar)

Daha çox yayılmış PCR inhibitorları bakteriyalarda və eukaryotik hüceyrələrdə, hədəfsiz DNT, DNT-nin bağlayıcı makromolekullarında və əlcəklər və plastiklər kimi laboratoriya avadanlıqlarında tapıla bilər. Çıxarış zamanı və ya sonra nukleik turşuların təmizlənməsi PCR inhibitorlarını çıxarmaq üçün seçilən üsuldur.
Bu gün müxtəlif avtomatlaşdırılmış hasilat avadanlığı bir çox əl ilə protokolları əvəz edə bilər, lakin 100% bərpa və / və ya hədəflərin təmizlənməsi heç vaxt nail olmayıb. Potensial inhibitorlar hələ də təmizlənmiş nukleik turşularda iştirak edə bilər və ya artıq qüvvəyə minmiş ola bilər. İnhibitorların təsirini azaltmaq üçün fərqli strategiyalar mövcuddur. Müvafiq polimerazın seçimi inhibitor fəaliyyətinə ciddi təsir göstərə bilər. PCR inhibisiyasını azaltmaq üçün digər sübut edilmiş metodlar, polimeraz konsentrasiyasını artırır və ya BSA kimi əlavələr tətbiq olunur.
PCR reaksiyalarının inhibisiyası daxili proses keyfiyyətinə nəzarət (IPC) istifadə etməklə nümayiş oluna bilər.
Etanol, Edta, Cetab, Lick, Guscn, SDS, SDS, SDS, ISOPropanol və Fenol kimi bütün reaksiya və digər həlləri çıxarmaq üçün qayğı göstərilməlidir, nuklein turşusu və phenol Konsentrasiyasından asılı olaraq, PCR-i aktivləşdirə və ya maneə edə bilərlər.